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劃重點:細胞培養(yǎng)該如何應對支原體污染!

更新時間:2021-10-15  |  點擊率:629
細胞培養(yǎng)技術的發(fā)現(xiàn),使得很多研究不必局限于在動物或人體內進行,試驗環(huán)境更為簡單,目的更為明確,如:細胞內活動的基礎研究;細胞與細胞相互作用;細胞與環(huán)境間的相互作用;遺傳學與細胞轉化;細胞產物和分泌等等。

細胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問題,面對支原體污染給細胞培養(yǎng)帶來的巨大難題,世界各國開始重視,并相繼建立了細胞庫,對細胞質量進展控制,效guo顯著,支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細胞的支原體有20多種以上,其中95%以上的支原體污染是口腔支原體。

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細胞微生物,分為兩個屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。革蘭染色為陰性,但不易著色,一般用Giemsa染色,染成淡紫色。

支原體的污染來源

(1)細胞之間交叉污染;

(2)細胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等;

(3)工作環(huán)境或實驗器材的污染;

(4)培養(yǎng)基的污染。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。細胞培養(yǎng)工作中,主要從以下幾個方面來預防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴格實驗操作;細胞培養(yǎng)和器材要保證無菌;在細胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

1、支原體檢測

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記,使PCR擴增后的產物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進行DNA擴增反應的實時監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點:①靈敏度高、特異性強。

②時間短,2-3小時出結果。

③檢測結果可定量。

④操作簡便。

缺點:①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補充驗證)

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大(由于引物及內在設計不同),需謹慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。

德國MB公司生產的支原體qPCR檢測試劑盒(均為探針法檢測),依據操作步驟的細微差別,

分『經典法』和『一步法』兩種。

2、環(huán)境空間消毒方案

試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱、液氮罐、移液器、門把手、電話等細胞培養(yǎng)環(huán)境

被支原體污染,可引起細胞的污染。應定期對工作區(qū)域進行消毒。

德國MB生產的Mycoplasma-offTM噴霧劑,或濕巾擦拭 5-10分鐘清除,對支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性,操作簡單方便。

截圖20211015090715.png

qPCR法介紹:

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記,使PCR擴增后的產物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進行DNA擴增反應的實時監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點:①靈敏度高、特異性強。

②時間短,2-3小時出結果。

③檢測結果可定量。

④操作簡便。

缺點:①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補充驗證)

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大(由于引物及內在設計不同),需謹慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導下使用。


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